Mem de Sá foi nomeado terceiro governador-geral do Brasil por Dom João III, por carta régia de 1556. Chegou a Salvador em dezembro de 1557 e governou até a morte. Tinha amplos poderes civis e criminais e firmou aliança com os jesuítas no aldeamento e na catequese dos indígenas.
Em 1560 comandou a expedição contra os franceses instalados na Guanabara, a chamada França Antártica. Seu sobrinho Estácio de Sá fundou a cidade do Rio de Janeiro em 1º de março de 1565, e os franceses foram expulsos em janeiro de 1567.
Em setembro de 1570 escreveu o Instrumento de serviços, pedindo para voltar a Portugal. Morreu em Salvador em março de 1572, ainda no cargo. Seu sucessor, Luís de Vasconcelos, havia sido morto por corsários franceses.